慢病毒载体的基本原理

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慢病毒载体系统由两部分组成，即包装成分和载体成分。与包装成分互补，即含有包装、逆转录和整合所需的HIV顺式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。

为降低两种成分同源重组恢复成野生型病毒的可能，需尽量减少二者的同源性，如将包装成分上5′LTR换成巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、3′LTR换成SV40 polyA等。

第二代慢病毒和第三代慢病毒的区别

慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。

特点：

1、区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，常用于感染难转染的细胞，如原代细胞、神经元细胞、干细胞、不分化细胞、心肌细胞、肝细胞、内皮细胞、肿瘤细胞，且效率近100%

2、可装载DNA片段容量高达5kb

3、目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，形成稳定遗传物质，使得目的基因在细胞中可稳定长期表达。

4、病毒载体颗粒通过包装元件和含病毒基因组质粒共转染包装细胞系。利用逆转录机制构建自我失活(SIV)的HIV-1来源的载体,一旦转移到靶细胞后,它就丧失了病毒长末端重复的转录能力,减少了产生重组病毒的机会,并避免了与启动子干扰的问题。

5、目前比较广泛采用的第三代包装系统——四质粒系统只含有HIV-1共9个基因中的3个，即gag、pol、rev。由于HIV-1基因组成分中60 %被去除,因此父代病毒无法复制，是目前重组系数最低的一个慢病毒包装系统，至今未见重组报道。其更安全、更稳定、更高效的技术优势领先于市场上的三质粒及其他包装系统。

综上特点决定了其应用、意义：

1、用慢病毒载体携带目的基因比用质粒瞬时转染更适于稳转株构建。

2、载体带有可进行高效率的包装、转染并稳定整合进靶细胞的基因组中的序列元件，其产生滴度更高，为活体动物模型实验提供高性价比的包含目的基因的病毒液。

3、其高转导效率及整合到基因组的特点为RNAi,cDNA 克隆以及报告基因的研究提供了一个有利的途径。

作为快速有效的遗传物质投递工具，慢病毒在国内已广泛流行，更有众多包装服务公司兴起。同时，克服了对病毒的恐惧心理而选择自己包装的研究者也陆续增加。外包服务和DIY（Do It Yourself）相比，后者成本会大大降低。仅需买一个包装试剂盒、构建一个慢病毒载体即可进行实验。GeneCopoeia公司提供了一款基于第三代包装系统的包装试剂盒。试剂盒中包含除慢病毒基础载体和包装细胞外的其他所有成分：包装辅助质粒混合物，滴度增强剂，慢病毒专用转染试剂（EndoFectin Lenti），eGFP阳性对照质粒。

慢病毒包装实验步骤与注意事项：材料准备：包装试剂盒、病毒质粒、细胞；（注意事项：包装试剂盒的使用遵照说明书。检测病毒质粒浓度，确保DNA的OD(260nm/280nm)处于1.8-2.0之间，并电泳检测质粒是否完整。包装实验前准备好细胞，保证细胞状态良好。）制备DNA/转染试剂复合物：此步骤比较简单，仅需按照试剂盒说明书操作。转染工具细胞：通常使用293Ta细胞，将DNA-Endofectin Lenti复合物加入到装有包装细胞的培养板中。在37℃、CO2环境下过夜培养（8-14小时），谨记培养6小时更换一次培养基，加入滴度增强剂TiterBoost，可增强滴度5-10倍。收获病毒：收集转染48小时后的培养液，500 *g离心10分钟，去除细胞碎片杂质。接着用0.45 μm的

聚醚砜蛋白结合过滤膜去除蛋白等杂质。收获纯度较高的病毒。检测滴度。

第二代慢病毒载体系统是在第一代基础的改进，在包装质粒中删去了HIV的所有附属基因。这些附属基因的去除并不影响病毒的滴度和转染能力，同时增加了载体的安全性。第三代慢病毒载体系统又增加了两个安全特性：一是构建了自身失活的慢病毒载体，即删除了U3区的3’ LTR，使载体失去HIV-1增强子及启动子序列，即使存在所有的病毒蛋白也不能转录出RNA；二是去除了tat基因，代之以异源启动子序列，这样原始的HIV基因组中的9个基因在慢病毒载体中只保留了3个（ gag、pol和rev）。因此第三代慢病毒载体系统更加安全。

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